Caractérisation de gènes de la famille des alcool deshydrogénases et alcool acyl transférases chez le melon cantaloup charentais

Abstract

L'arôme est un des attributs principaux de la qualité des fruits. Ces composés sont synthétisés au cours du processus de maturation. Leur synthèse est sous la dépendance de l’éthylène dans les fruits climactériques tels que le melon. Un pourcentage important des composés volatils contribuant à l’arôme de nombreux fruits est constitué par des esters. La voie de biosynthèse des esters à partir d’acides gras et des acides aminés est contrôlée par deux enzymes clés, l’alcool déshydrogénase (ADH) et l’alcool acyl-transférase (AAT). L’ADH participe à l’interconversion des aldéhydes en alcools et fournit ainsi des substrats pour la formation des esters. Nous avons isolé dans cette thèse deux gènes fortement divergents codant pour des ADHs (15 % d'identité au niveau d'acide aminé) dans le melon cantaloup Charentais (Cucumis melo variété cantalupensis). Cm-ADH1 appartient à une classe d’ADHs de moyenne longueur et Cm-ADH2 à une classe à courte chaîne. Les deux protéines exprimées dans la levure sont enzymatiquement actives. Cm-ADH1 a une forte préférence pour le NAPDH comme cofacteur, tandis que Cm-ADH2 utilise préférentiellement le NADH. Les deux protéines sont plus efficaces comme réductases. Elles ont en effet des Kms 10 à 20 fois inférieurs pour la conversion des aldéhydes en alcools que pour la déshydrogénation des alcools en aldéhydes. Toutes les deux ont une forte préférence pour les aldéhydes aliphatiques. Cependant Cm-ADH1 est capable de réduire les aldéhydes ramifiés tels que le 3-methylbutyraldéhyde alors que Cm-ADH2 en est incapable. Les deux gènes sont exprimés spécifiquement dans le fruit et leur expression augmente pendant la maturation. Les transcrits des deux gènes ainsi que l’activité ADH totale sont fortement réduites dans les melons AS-ACO (AS) et dans les melons non transformés (WT) traités avec 1-MCP, démontrant que l’éthylène exerce une régulation positive sur l’expression des deux gènes d’ADH. L’AAT réalise l’acylation des alcools pour produire des esters. Nous démontrons dans cette thèse que le melon cantaloup Charentais exprime au moins quatre gènes correspondent à l’AAT : Cm-AAT1, Cm-AAT2, Cm-AAT3 et Cm-AAT4. Toutes les protéines codées par ces gènes, excepté Cm-AAT2, sont enzymatiquement actives et sont capables de produire des esters volatils lorsqu’elles sont exprimées dans la levure. Chacune de ces protéines montre des préférences spécifiques pour la formation d’esters. Cm-AAT1 est capable de produire des esters à courte et longue chaîne avec différents acyls-CoA, mais avec une préférence marquée pour la formation d'acétate d'E-2-hexenyl et d'hexanoate hexyle. Cm-AAT3 accepte également un grand nombre de substrats mais elle présente une préférence très forte pour la production d’acétate de benzylique. Quant à Cm-AAT4 elle produit presque exclusivement des acétates et a une forte préférence pour la formation d’acétate de cinnamoyle. Une mutagenèse dirigée a montré que l’absence d’activité de production d’esters volatils de Cm-AAT2 est liée à la présence d'un résidu 268 d’alanine à la place d’une thréonine alors que toutes les protéines actives étudiées jusque là possèdent cette thréonine. L’activité de chacune de ces trois protéines s’accroît fortement pendant la maturation du melon. Cependant, des melons antisens-ACC Oxydase (AS) qui ne produisent pas d’éthylène ont une très faible activité AAT. D’ailleurs, l’expression des 3 gènes Cm-AAT est fortement réduite dans le melon AS et après traitement de melons non transformés (WT) traités avec l’inhibiteur d’action de l’éthylène, 1-MCP. Ceci démontre que l’éthylène est le régulateur principal de l’expression de ces gènes. Une étude biochimique des protéines recombinantes a été réalisée. Elle montre que les protéines ont une masse moléculaire de 200 kDa environ correspondant à des tétramères. Les protéines natives extraites de melon ont une masse moléculaire identique. Les Km des trois protéines recombinantes (Cm-AAT1, Cm-AAT3 et Cm-AAT4) sont de 1,23, 1,9 et 0,15 mM vis-à-vis de l’acétyl CoA et 0,56, 0,67 et 0,32 mM vis-à-vis de l’alcool. Selon le niveau, le CoA-SH produit par la réaction peut être activateur ou inhibiteur. Des cinétiques réalisées en présence d’une enzyme capable d’éliminer l’interférence du CoA-SH (phosphotransacétylase) montrent en général un très forte diminution du Km vis-à-vis de l’acétyl CoA , sauf pour Cm-AAT3. Le Ki relatif à l’inhibition par le CoA-SH est voisin de -0,90 mM pour les trois enzymes. Les données de cette thèse suggèrent que chacune des protéines AAT et ADH joue un rôle spécifique dans la biosynthèse d'esters volatils odorants chez le melon.